液氮罐凍存樣品的方法 ：(以獨(dú)立樣品pc12為例)

　　1、選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。一般長(zhǎng)約為70%-80%即可凍存，細(xì)胞數(shù)目過(guò)少或過(guò)多都不宜凍存，因?yàn)閺?fù)蘇后細(xì)胞生存率會(huì)降低;收集細(xì)胞24小時(shí)前換液一次。

　　2、用培養(yǎng)液直接將細(xì)胞消化下來(lái)，離心，1000轉(zhuǎn)， 5min;

　　3、吸去上清，在離心管中加入凍存液，(凍存液配制按照60%已過(guò)濾的培養(yǎng)基 + 10%DMSO+ 10%胎牛血清+20%馬血清配置凍存液(其中DMSO要自己配置)， 4度保存?zhèn)溆谩?，加入凍存液后吹散計(jì)數(shù)，控制細(xì)胞懸液密度為5*106或1*107左右(不過(guò)有人建議其實(shí)不必要細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞的多少，估計(jì)一下一瓶細(xì)胞凍存幾支就行了，細(xì)胞密度高一點(diǎn)比較好，操作時(shí)間短，對(duì)細(xì)胞損傷小。)， 細(xì)胞懸液以1ml的量分裝入凍存管中(每個(gè)凍存管添加不超過(guò)1-1.5m)，在凍存管上標(biāo)記凍存日期，姓名以及細(xì)胞種類。最好選擇進(jìn)口的凍存管;

　　4、要嚴(yán)密封口，慢凍過(guò)程(1.先將凍存管放入4℃冰箱，約1H。 2.接著置于-20℃冰箱，約40min-1h。 3.置于-80超低溫冰箱中放置過(guò)夜。 4.置于液氮罐中長(zhǎng)期保存。) ， 注意將凍存管豎立于合適大小的不銹鋼飯盒中，應(yīng)避免凍存管倒立。

　　液氮罐凍存樣品的注意事項(xiàng)：

　　1、使用DMSO前，不需要進(jìn)行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會(huì)破華它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下，DMSO對(duì)人體有害，故在配制時(shí)最好戴上手套操作。最好使用前將DMSO4度凍一下，對(duì)細(xì)胞的毒性會(huì)減少。

　　2、不宜將凍存細(xì)胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內(nèi)過(guò)久，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi)，是“危險(xiǎn)溫區(qū)”。

　　3、注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時(shí)添加。

　　4、多余的凍存液可以4度保存?zhèn)溆谩?/p>